近期，中國科學院北京基因組研究所米雙利研究組與清華大學生命科學學院姚駿研究組合作,建立了動物腦內基于CRISPR interference (CRISPRi)的多重基因條件性敲低平臺，為在體研究復雜蛋白復合物的功能和多基因神經疾病的發病機理提供了重要的工具。該成果于2018年2月在Nature Neuroscience雜志在線發表。

　　基因特異性的失活策略是基因功能研究的重要方法，以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯工具已被廣泛用于建立轉基因細胞株和動物模型。隨著基因功能研究的發展，單一基因的敲除/敲低已經不足以滿足研究者的要求,尤其是對于復雜的多蛋白復合物和多基因神經疾病，多重基因元素失活的條件性組合搭配正日益成為主流需求。然而，逐一構建不同基因的敲除/敲入動物模型再進行雜交，受限于低下的制備效率、冗長的制作周期和昂貴的成本費用，已成為研究中的主要瓶頸之一。另外，CRISPR/Cas9切割后產生的非同源末端連接修復常常導致非特異性的刪除、插入或其它突變，導致在單細胞水平產生多種表型變化，例如雜合型、純合失活型和野生型等，可能會對后續實驗產生嚴重的干擾。

　　在該研究中，研究人員利用病毒傳遞策略，針對神經元構建了優化的基于dCas9的CRISPRi系統，達到在小鼠腦內進行高效且靶向特異性的抑制功能基因表達的目的。該系統能夠在神經元的單細胞水平獲得均一的表型，而且在基因沉默能力上顯著優于傳統的RNAi技術。同時，利用sgRNA相隔錯配的策略，在神經元中實現了精確的靶向特異性基因抑制，幾乎不產生脫靶效應。

　　研究人員進一步在動物腦內拓展了該技術的應用。利用神經元亞群特異性的啟動子，條件性控制功能基因Syt1在海馬齒狀回興奮性和抑制性神經元中的獨立失活，實現了對局部神經網絡興奮/抑制平衡的雙向調節。最后，研究人員開發了基于一體化載體和雙載體的兩套CRISPRi多重基因抑制系統，分別成功實現了小鼠腦內syt1及其互作網絡蛋白共5重基因的同時抑制，且能夠實現靈活多變的多基因不同組合的高效失活。

　　該研究證實，針對神經元的CRISPRi能夠在動物出生后的各個階段以及不同生理及病理狀態下實現在體操作，建立細胞和動物模型，解析多重基因及基因通路與復雜表型之間的關系。該成果為探索復雜腦疾病的致病機理，尋求新型治療策略，提供了靈活而高效的基因編輯工具。

　　該研究獲得了科技部重點研發專項、國家自然科學基金、中國科學院精準基因組醫學重點實驗室開放課題等基金的資助。

　　論文鏈接

　 CRISPRi在小鼠腦內進行條件性敲低和多重敲低的設計示意圖